Tehnica patch-clamp este numele dat unei tehnici de măsurare electrofiziologică. Permite măsurarea curenților ionici prin canale individuale în cadrul unei membrane plasmatice.
Care este tehnica patch-clamp?
Tehnica patch clamp sau metoda patch clamp aparține electrofiziologiei, care este o ramură a neurofiziologiei care se ocupă cu transmiterea electrochimică a semnalelor în sistem nervos. Cu ajutorul acestei metode, este posibil să vizualizați canale ionice individuale în membrana celulara a unei celule corporale. Aceasta implică măsurarea curenților câtorva picoamperi. Tehnica patch-clamp a fost descrisă pentru prima dată în 1976 de biofizicianul german Erwin Neher și de medicul german Bert Sakmann. Cei doi oameni de știință au primit Premiul Nobel pentru fiziologie sau medicină în 1991 pentru dezvoltarea tehnicii clamp-patch. Astfel, cercetarea electrofiziologică a fost practic revoluționată de tehnica patch-clamp, deoarece a deschis posibilitatea observării comportamentului electric la nivelul membranei proteine de individ molecule. Termenul patch vine din limba engleză și înseamnă „patch”. Se referă la o mică secțiune de membrană sub pipeta plasturelui, care este utilizată ca electrod de măsurare. În timpul procesului de măsurare, patch-ul de membrană este fixat sau fixat (pentru a fixa) la potențialele specificate.
Funcția, efectul și obiectivele
Tehnica patch-clamp este o metodă de analiză electrofiziologică. Se bazează pe faptul biologic că celulele au un număr mare de pori și canale ionice. Diferite concentrații de ioni sau încărcături apar în interiorul și în afara fiecărei celule, care depinde de starea fiziologică a celulei. Stratul stratificat lipidic al membranei nu este permeabil la de apă molecule precum și ioni. Cu toate acestea, un schimb de particule încărcate are loc peste membrana celulara la intervale neregulate. Motivul pentru aceasta este dependența de tensiune a canalelor ionice. Dacă se atinge un anumit potențial de membrană, canalele sunt deschise conform principiului „totul sau nimic”. Exact aici intervine tehnica de fixare a patch-urilor. În acest fel, o pipetă de măsurare este avansată către un canal ionic fără a pătrunde în membrana celulara. În acest fel, potențialul electric local poate fi determinat cu precizie. Curenții de scurgere, care ar putea afecta rezultatul măsurătorii, pot fi de obicei evitate prin conexiuni extrem de strânse electric între marginea pipetei și membrana celulei. Metoda de fixare a patch-urilor se bazează pe tehnica de fixare a tensiunii. Această tehnică a fost dezvoltată în anii 1930 de biofizicianul american Kenneth Stewart Cole (1900-1984) pentru a măsura curenții de pe celulele nervoase care sunt intacte. În clema de tensiune, introducerea a doi electrozi într-o celulă are loc pentru a furniza o comandă sau o tensiune de reținere. În același timp, un alt electrod este utilizat pentru a înregistra curenții care apar pe membrană. Dacă neurofiziologii vor să știe despre fluxul curenților electrici prin zone specifice ale unui celula nervoasa membrană, utilizează tehnica patch clamp. Pentru a face acest lucru, ei folosesc o pipetă de sticlă fină, care este plasată în exteriorul celulei. Presiunea negativă poate fi creată prin aspirarea acesteia cu ajutorul unei seringi hipodermice. Această procedură face ca membrana să umfle ușor la locul corespunzător. Presiunea negativă asigură atașarea sticlei la membrană. Acest lucru are ca rezultat izolarea electrică a micii pete de membrană din pipetă de restul membranei. Pentru a măsura curenții electrici, neurofiziologii folosesc un amplificator cu clemă. Acesta este un dispozitiv special de măsurare. În cazul ideal, omul de știință poate folosi dispozitivul pentru a obține informații despre proprietățile electrice ale canalelor ionice individuale. Canalele ionice reglează, de exemplu, intrarea și ieșirea de sodiu ioni, care sunt încărcați pozitiv, în celulele nervoase. Ancheta are loc pe celulele oamenilor, plantelor sau animalelor. Metoda patch-clamp se efectuează de obicei la o stație de măsurare care include diverse dispozitive. Pe masa de măsurare amortizată de vibrații există o așa-numită cușcă Faraday, care servește drept scut electric. Mai mult, un microscop optic care include un micromanipulator este disponibil pentru a aduce pipeta patch-ului în poziție. În plus, suportul pentru pipetă are o conexiune la un preamplificator, în timp ce suportul pentru probă este conectat la un electrod de baie. Amplificatorul patch clamp funcționează pentru a amplifica semnalul preamplificatorului. Un monitor este, de asemenea, furnizat pentru a observa DUT, precum și pipeta de patch-uri. În majoritatea cazurilor, un computer și mai multe dispozitive de stocare a datelor sunt de asemenea disponibile la masa de măsurare pentru a permite înregistrarea digitală.
Riscuri, efecte secundare și pericole
Nu există riscuri asociate cu tehnica patch-clamp. De exemplu, celulele de la oameni, animale sau plante nu sunt examinate decât după ce au fost îndepărtate. Accesul nerestricționat la membrana celulară exterioară există rareori. Din acest motiv, este adesea necesar să se pregătească celulele pentru metoda patch-clamp. După umplerea pipetei plasturii, aceasta este prinsă într-un micromanipulator. Acesta este conectat la amplificatorul cu clemă și este presat ușor pe o celulă care este intactă. Procesul poate fi urmat cu un monitor sau microscop. Sub pipetă se află o bucată de membrană numită plasture de membrană. Presiunea negativă ușoară creată la capătul din spate al pipetei asigură o conexiune puternică între pipetă și membrană. Acest proces are ca rezultat crearea unei rezistențe electrice între soluția externă și interiorul pipetei a mai multor gigaohmi. Oamenii de știință se referă, de asemenea, la acest lucru ca "gigaseal", care permite realizarea configurației atașate celulei a metodei patch-clamp. Curentul care curge printr-un canal ionic din plasture curge, de asemenea, prin conținutul pipetei datorită rezistenței gigaseale ridicate. Un electrod conectat la amplificator este scufundat în soluția pipetei, permițând măsurarea activităților canalelor ionice individuale din membrana plasturii.
