Reacția în lanț a polimerazei reprezintă o procedură din biologia moleculară care duplică secțiuni din materialul genetic (acidul dezoxiribonucleic, ADN). Milioane de copii identice sunt produse din cantități mici de ADN. În acest fel, sunt disponibile cantități care sunt suficiente pentru diverse investigații.
Care este reacția în lanț a polimerazei?
Reacția în lanț a polimerazei reprezintă o metodă din biologia moleculară care duplică secțiuni din materialul genetic (acidul dezoxiribonucleic, ADN). Termenul de reacție în lanț a polimerazei (PCR) descrie reacția in vitro (latină: în sticlă) cu ajutorul unei enzime, polimeraza (ADN polimeraza), care duce la duplicarea anumitor genă secvențe. Produsul reacției este, de asemenea, materia primă pentru un nou ciclu al acestei reacții. Numarul molecule dublează și în același timp servește ca șablon pentru un nou ciclu. Aceasta se numește multiplicare exponențială. Are loc în laborator la o viteză mare de câteva minute, similar cu o reacție în lanț. Acest proces de laborator imită duplicarea informațiilor genetice (ADN) care au loc în condiții naturale în timpul replicării. Chimistul american KB Mullis este considerat descoperitorul acestui proces. În 1983, a introdus acest proces de sinteză a ADN-ului și zece ani mai târziu a primit Premiul Nobel pentru chimie.
Funcția, efectul și obiectivele
În organismele vii, ADN-ul din cromozomi are o lungime care nu poate fi amplificată folosind PCR. În schimb, se aplică pentru a amplifica o secțiune definită. Acestea pot fi gene, o parte specifică a genă, sau regiuni care nu sunt transcrise în proteine, adică sunt necodificate. Aceste secțiuni cuprind de obicei nu mai mult de trei mii de perechi de baze, comparativ cu aproximativ două ori trei miliarde de perechi de baze per set de cromozomi în oameni. Reacția în lanț a polimerazei necesită un lanț ADN monocatenar sau dublu catenar a cărui structură trebuie să fie cel puțin parțial cunoscută. În plus față de enzimă, polimeraza, se folosesc și doi grunduri. Acestea sunt blocuri ale ADN-ului care acționează ca punct de pornire și de sfârșit. Acestea sunt caracterizate printr-o secvență care se potrivește exact cu regiunea de amplificat. În laborator, reacția în lanț a polimerazei se efectuează într-un bloc de încălzire programabil. Componentele necesare, cum ar fi polimeraza, grundul, elementele de construcție pentru construirea noului fir (dezoxiribonucleozid trifosfați) magneziu ionii sunt adăugați împreună într-o soluție tampon. Programul temperatură-timp pentru reacție începe cu denaturarea la o temperatură peste 94 ° C. În acest proces, ADN-ul cu catenă dublă este clivat și este prezent în formă monocatenară. În etapa următoare, la aproximativ 70 ° C, grundul este legat de genă secvență și formează punctul de plecare pentru reacția enzimatică. De aici, polimeraza sintetizează catena complementară. Apoi începe un nou ciclu, care constă din nou în cele trei etape de denaturare, legarea primerului și sinteza catenei ADN. Reacția în lanț a polimerazei este utilizată în medicina criminalistică, diagnosticarea clinică și cercetarea clinică. În știința criminalistică, ADN-ul este extras din piele, salivă, păr, material seminal sau sânge din scenele crimei și, după amplificare, comparate cu eșantioane cunoscute și utilizate pentru a identifica indivizi specifici. Folosind această amprentă genetică, paternitatea poate fi, de asemenea, clarificată printr-o abordare modificată. În elucidarea bolilor, reacția în lanț a polimerazei este utilizată pentru a verifica genele implicate. Unele boli bacteriene pot fi clasificate prin recunoașterea secvențelor specifice. Bolile virale pot fi caracterizate atunci când ADN-ul sau ARN-ul viral este transformat și amplificat. În sânge screening, este posibil să se detecteze hepatită sau bolile mediate de HIV într-un stadiu foarte timpuriu. În diagnosticul tumorii, este utilizat pentru identificarea celulelor tumorale. Acest lucru face posibilă clasificarea tumorii, evaluarea evoluției bolii, succesul terapie și prognosticul. În cercetare, reacția în lanț a polimerazei este utilizată pentru a identifica genele asociate cu diferite boli. Pentru clonarea genelor, care nu este aceeași cu clonarea unui organism, gena este amplificată înainte de a fi transferată către alte organisme într-un vector (latină: călător, purtător ). Acestea pot acționa ca modele pentru a studia mai bine boala sau pentru a produce proteine care poate fi folosit ca medicamente.
Riscuri și pericole
Reacția în lanț a polimerazei are un potențial imens în detectarea unor cantități mici de ADN. Pentru a profita de multitudinea de posibilități și pentru a ne feri de erori importante, trebuie luate în considerare anumite condiții prealabile și diverse surse de eroare. Doar secțiunile materialului genetic a căror secvență este cel puțin parțial cunoscută pot fi amplificate. Secvențele complet necunoscute nu pot fi amplificate prin această metodă. Produsele unei amplificări pot fi vizualizate ulterior. Dacă semnalul așteptat nu este vizibil, deși secvența căutată a fost prezentă, este prezent un rezultat fals negativ. Cel mai adesea, acesta este rezultatul unor condiții de reacție neoptimizate sau slab optimizate. Acestea trebuie determinate în funcție de secvența țintă. În acest scop, sunt testate diferite profiluri de temperatură și timp, secvențe de grund și cantități, precum și concentrații de alte substanțe în amestecul de reacție. Rezultatele pozitive false apar ca semnale care nu pot fi atribuite produsului dorit. Problemele majore sunt cauzate de contaminări cu ADN provenind de la investigator sau de la o altă sursă decât cea care urmează să fie analizată. ADN-ul de origine bacteriană influențează, de asemenea, rezultatul unei reacții în lanț a polimerazei. Purtând mănuși și având mare grijă, astfel de erori pot fi prevenite și pot fi formulate concluzii fiabile despre produsele amplificate.
