Ce este un test PCR?
Un test PCR este o metodă de laborator utilizată în biologie moleculară și medicină. Testul este utilizat pentru detectarea directă – și caracterizarea – a materialului genetic. Metoda PCR este considerată de experți a fi ușor de realizat, aplicabilă universal și robustă.
În laborator, un test PCR constă din două etape. În prima etapă, materialul genetic existent este amplificat folosind reacția în lanț a polimerazei (PCR). Acest lucru permite examinarea celor mai mici urme de ADN. Acesta este și motivul pentru care testele PCR reacționează atât de sensibil.
Într-o a doua etapă, materialul genetic este separat în funcție de proprietățile sale, „sortat” și astfel caracterizat. Cu alte cuvinte, este determinată structura fină a ADN-ului.
Există multe aplicații posibile: medicii folosesc un test PCR, de exemplu, pentru a examina tampoanele pentru prezența coronavirusurilor, a donațiilor de sânge pentru HIV sau pentru a depista nou-născuții pentru posibile boli ereditare. Infecțiile bacteriene – de exemplu cu agentul patogen al tuberculozei – sau infecțiile parazitare (malaria) pot fi, de asemenea, clarificate folosind PCR.
De asemenea, ajută la condamnarea agresorilor în medicina legală pe baza amprentelor lor genetice sau sunt folosite ca teste de paternitate.
Cât timp este valabil un test PCR?
Un rezultat al testului PCR este de obicei valabil timp de 48 de ore de la prelevarea probei.
Cât de fiabil este un test PCR?
PCR este o metodă de detectare încercată și testată în diagnosticul molecular și medicină. Este considerat așa-numitul standard de aur cu o rată de eroare foarte scăzută. Testele se caracterizează în special printr-o sensibilitate și specificitate foarte ridicate.
Sensibilitatea înseamnă fiabilitatea cu care un test găsește materialul genetic care trebuie detectat.
Specificitatea înseamnă certitudinea cu care testul determină că materialul genetic în cauză nu este prezent în eșantion.
Când funcționează testele PCR pentru o infecție cu Sars-CoV-2?
De regulă, testul PCR detectează o infecție corona cu două până la trei zile înainte și până la 20 de zile după apariția simptomelor. Chiar și la persoanele infectate care rămân complet lipsite de simptome, testul este eficient într-o fereastră de timp critică în care pot infecta pe alții.
În cazuri individuale, detectarea este posibilă chiar și la 60 de zile de la apariția simptomelor.
Surse posibile de eroare
Rata de eroare în procesul de copiere a ADN-ului este neglijabilă în practică. Deși ADN-polimerazele nu sunt niciodată lipsite de erori, cu greu joacă un rol în procedura de testare PCR.
În practică, sursele potențiale de eroare se află mai mult în colectarea probelor: prin urmare, este important ca profesioniștii medicali instruiți să efectueze tampoanele. Probele de saliva și gargară ar putea reduce acuratețea testului, deoarece aici apar efecte de diluare.
Cum funcționează un test PCR?
Un test PCR este efectuat, de exemplu, de un medic de familie sau în centre speciale de testare. În primul rând, medicii sau profesioniștii medicali instruiți iau o probă. Un tampon este de obicei luat din tractul respirator superior pentru test. Acesta ia de obicei forma unui tampon bucal sau nazofaringian.
Este posibilă și gargara cu o soluție de clătire. O probă de sânge este atipică pentru detectarea corona – dar utilizată pe scară largă în screening-ul nou-născuților, de exemplu.
Indiferent de tipul de probă prelevată, materialul genetic se găsește pe tampon de vată, în soluția de clătire sau în picătura de sânge. Acest material de probă este trimis la un laborator, unde este izolat și purificat.
Un test PCR este apoi împărțit în două etape:
- PCR: În această etapă, cantitatea de material genetic inițial este amplificată.
Pasul 1: PCR – „Reacția în lanț a polimerazei”
„PCR” este primul dintre cei doi pași: Aici este amplificată cantitatea de ADN inițial disponibilă. Acest lucru se datorează faptului că materialul genetic poate fi analizat numai după ce este disponibil în cantități suficiente. În cele mai multe cazuri, acesta este ADN uman; în cazul testelor pentru coronavirus, este vorba de ARN viral.
Abrevierea PCR înseamnă „reacție în lanț a polimerazei”.
Ce este necesar pentru un PCR?
ADN-ul de pornire este plasat într-un vas de reacție cu substanțe speciale. Materialul genetic existent servește ca șablon, care este copiat în prezența anumitor enzime (polimeraza Taq) și a anumitor blocuri de bază ale ADN-ului.
Procesul de copiere are loc în mai multe rulări (cicluri) repetitive.
Mai exact, se adaugă următoarele substanțe:
- ADN inițial: material de probă care urmează să fie copiat.
- Blocuri de bază ale ADN-ului: Acestea sunt bazele nucleoase adenină, timină, citozină și guanină.
- ADN polimerază: O enzimă care leagă blocurile individuale ale ADN-ului pentru a forma o catenă de ADN bine definită. Șuvița nou obținută este o imagine în oglindă (complementară) a materiei prime originale.
- Primeri: sunt formați din 16 până la 24 de perechi de baze și servesc ca poziție de pornire și semnal de pornire. Primerii arată ADN-polimeraza în care poziție (a ADN-ului inițial) începe procesul de copiere.
Cum se efectuează un test PCR?
Acum că toate substanțele necesare pentru o PCR sunt prezente în vasul de reacție, procesul propriu-zis de copiere a materialului genetic poate începe. Acesta este pornit, controlat și oprit din nou numai de temperatură.
Vasul de reacție este așadar încălzit sau răcit la temperaturi diferite unul după altul. Acest lucru se face folosind un dispozitiv special cunoscut sub numele de termociclator. Întreaga reacție durează aproximativ una până la două ore.
Etapele individuale ale unui ciclu PCR sunt
- Denaturarea catenelor duble de ADN: Proba este încălzită la aproximativ 90 de grade Celsius. Aceasta separă dubla catenă originală de ADN în două catene simple individuale (complementare).
- Atașarea grundurilor: Temperatura este scăzută cu puțin sub 60 de grade Celsius. Acest lucru face ca primerii (primerul direct, primerul invers) să se atașeze la poziții definite pe catenele individuale de ADN corespunzătoare.
După un ciclu încheiat, temperatura este ridicată din nou la aproximativ 90 de grade Celsius – ciclul începe din nou de la început.
Metoda PCR poate fi utilizată pentru a amplifica secvențe de ADN de până la aproximativ trei perechi de kilobaze (kbp). Aceasta corespunde a aproximativ 3,000 de blocuri de bază ale ADN-ului legate între ele pentru a forma un „lanț”. Pentru comparație: genomul uman stochează planurile și informațiile pentru funcționarea celulei în aproximativ trei miliarde de perechi de baze – genomul coronavirusului, pe de altă parte, este format din 30,000 de perechi de baze. Prin urmare, un test PCR poate doar amplifica și examina secțiuni scurte din ADN-ul total.
Amorsele sunt cruciale
Alegerea primerilor este crucială pentru procedura PCR. În diagnosticul Sars-CoV-2, de exemplu, sunt utilizați mai mulți primeri (PCR multiplex).
Testele Corona PCR caută astfel trei gene diferite ale virusului: Aceasta crește specificitatea generală la aproape 99.99%. Aceasta înseamnă că, cu această rată mare de succes, există doar un test fals pozitiv la 10,000 de teste (dacă probele sunt prelevate corect).
Cât de mult material genetic copiat este acum disponibil?
Să presupunem că două catenele duble ADN identice sunt prezente după primul ciclu.
După fiecare ciclu, cantitatea de material genetic (copiat) se dublează. Prin urmare, cantitatea de ADN crește exponențial.
Medicii repetă de obicei acest proces de aproximativ douăzeci până la treizeci de ori.
Figurat vorbind, asta înseamnă că, chiar dacă la început se găsește doar o singură catenă dublă de ADN în probă, după douăzeci de cicluri există deja un milion de copii identice în vasul de reacție.
Ce înseamnă valoarea Ct?
Numărul de cicluri PCR rulate este indicat sub forma așa-numitei valori Ct. „Ct” este derivat din termenul englezesc „cycle threshold”. Această valoare Ct face posibilă efectuarea de declarații despre cantitatea de material genetic căutat.
Cu o valoare Ct scăzută de 20, există o mulțime de material genetic inițial. Cu toate acestea, dacă valoarea Ct este mare – în jur de 30 de cicluri – există, în mod corespunzător, puțin ADN. Prin urmare, ciclul PCR trebuie rulat mai des.
Pasul 2: Electroforeză „Sortare după dimensiune”
Odată ce este disponibil suficient material genetic „îmbogățit”, se poate efectua electroforeza. În acest proces, oamenii de știință exploatează o proprietate specifică a ADN-ului: sarcina sa electrică.
Blocurile individuale ale ADN-ului sunt legate între ele printr-o coloană vertebrală de zahăr-fosfat încărcată (negativ). Cu cât o anumită secvență de ADN este mai lungă, cu atât sarcina sa electrică este mai mare.
Acest lucru permite ca materialul genetic să fie examinat și caracterizat. În practică, un eșantion necunoscut este de obicei trasat pe o referință cunoscută pe o „linie de plecare” și comparat unul cu celălalt după o anumită perioadă de timp.
Dacă „viteza de migrare” este aceeași pentru ambele secvențe, aceasta înseamnă că detecția este cel mai probabil pozitivă: detecția este foarte probabil pozitivă – gena pe care o căutați este conținută în probă.
Caz special de coronavirus: pregătirea probelor și RT-PCR
Detectarea coronavirusului este un caz special. Sars-CoV-2 este unul dintre așa-numitele viruși ARN. Aceasta înseamnă că materialul genetic Sars-CoV-2 este prezent sub formă de ARN (acid ribonucleic).
ARN-ul diferă de ADN doar în câteva privințe. Printre altele, este prezent ca o singură catenă și se bazează pe riboză de zahăr în loc de 2′-dezoxiriboză. Timina nucleobază este, de asemenea, înlocuită cu uracil ca bază a patra.
Acest ARN viral trebuie „transcris” în ADN înainte de un test PCR obișnuit. Acest proces se numește transcripție inversă (RT) – de unde și termenul RT-PCR. O singură catenă de ADNc („ADN complementar”) este obținută ca parte a acestui proces. Într-o etapă ulterioară, catenă simplă de ADNc este suplimentată cu o a doua catenă de ADN cu imagine în oglindă.
Cât timp durează pentru a obține rezultatul?
Odată ce proba a fost trimisă la laborator, veți primi de obicei un rezultat în termen de una sau două zile lucrătoare. În centrele de testare, care examinează adesea mostrele direct la fața locului, poate dura și doar câteva ore. Perioada de timp depinde în mare măsură de centrul de testare respectiv și de logistica acestuia.
În ciuda proceselor complexe de lucru, laboratoarele moderne sunt capabile să efectueze teste PCR cu un randament ridicat. Dispozitivele automate speciale ajută la efectuarea testelor.
Cu toate acestea, testul PCR este considerat o metodă de detecție relativ „lentă”, dar cu atât mai fiabilă.
Ce se întâmplă dacă rezultatul este pozitiv?
Dacă proba este prelevată corect, un test PCR pozitiv înseamnă că există o probabilitate foarte mare ca persoana testată să fie infectată cu Sars-CoV-2.
Dacă vi s-a confirmat că sunteți infectat cu coronavirus prin intermediul unui test PCR, departamentul de sănătate publică va primi notificare cu privire la rezultatul testului pozitiv de la laboratorul relevant. În acest caz, departamentul de sănătate publică va dispune izolarea sau carantina.
Sunt automat contagios dacă testez pozitiv pentru PCR?
De obicei da. Dar nu in totdeauna. Rezultatul unui test PCR trebuie interpretat întotdeauna în context. Un test pozitiv înseamnă în primul rând că porți material viral.
Un test suplimentar de anticorpi este uneori util
În astfel de cazuri, un test de anticorpi oferă o certitudine care confirmă validitatea testului PCR. Cel mai bine este să discutați acest lucru cu medicul dumneavoastră. Ele vă pot ajuta să interpretați corect rezultatul testului PCR.
Ce să faci dacă rezultatul este negativ?
Un rezultat negativ al testului PCR înseamnă cel mai probabil că nu ați avut Covid-19 la momentul prelevarii probei și, prin urmare, nu sunteți infecțios în prezent. Cu toate acestea, ați putea fi într-o fază incipientă a infecției.
Infecțiile cu corona pot fi detectate de obicei doar din a doua sau a treia zi după infectare. Prin urmare, rezultatul nu este o trecere gratuită. Prin urmare, ar trebui să respectați în continuare regulile de distanțare socială și de igienă și să continuați să purtați o mască FFP2 - pentru propria dumneavoastră și a celorlalți.
Test PCR pentru copii
Un test PCR pentru copii nu este diferit de un test PCR pentru adulți. Atât colectarea probelor, cât și interpretarea rezultatelor se aplică atât copiilor, cât și adulților.
Care sunt riscurile unui test PCR?
Un test PCR nu implică niciun risc fizic. Doar recoltarea probei prin tampon nazofaringian este percepută de unele persoane ca deranjantă sau neplăcută.
Cât costă un test PCR?
Vă rugăm să rețineți: dacă v-ați testat acasă și ați primit un rezultat pozitiv, ar trebui să faceți imediat o programare la medicul de familie prin telefon. Medicul dumneavoastră va discuta cu dumneavoastră următorii pași la telefon.
Alternativ, cel mai bine este să sunați la 116 117 pentru a vă înregistra pentru un test PCR. Ideal ar fi să stai acasă până la testul de confirmare pentru a te proteja pe tine și pe ceilalți.
